在网站中添加一个Global.asax全局应用程序文件。

protected void Application_Start(object sender, EventArgs e)
{
    Application["onLine"] = 0;
}
protected void Session_Start(object sender, EventArgs e)
{
    Application.Lock();                                        //锁定Application
    Application["onLine"] = (int)Application["onLine"] + 1;    //在线人数加1
    Application.UnLock();
}
protected void Session_End(object sender, EventArgs e)
{
    Application.Lock();                                          //锁定Application
    Application["onLine"] = (int)Application["onLine"] - 1;      //总访问数量不变，在线人数减1
    Application.UnLock();                                        //解除锁定
}

前台页面调用：

在线人数：<%=Application["onLine"] %>